{"id":74462,"date":"2021-01-27T11:27:31","date_gmt":"2021-01-27T14:27:31","guid":{"rendered":"https:\/\/www.institutodeengenharia.org.br\/site\/?p=74462"},"modified":"2023-01-09T11:34:10","modified_gmt":"2023-01-09T14:34:10","slug":"o-teste-rt-pcr-para-identificacao-do-sars-cov-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.institutodeengenharia.org.br\/site\/2021\/01\/27\/o-teste-rt-pcr-para-identificacao-do-sars-cov-2\/","title":{"rendered":"O teste RT-PCR para identifica\u00e7\u00e3o do Sars-CoV-2"},"content":{"rendered":"

O teste RT-PCR (Real Time Polimerase Chain Reaction) constitui na resposta final e precisa sobre a presen\u00e7a do Sars-CoV-2, pertencente a fam\u00edlia coronavidae<\/em>, denominado tamb\u00e9m de novo coronav\u00edrus, na amostra analisada. Por ser considerada uma t\u00e9cnica molecular altamente sens\u00edvel e espec\u00edfica, \u00e9 considerado, desde o in\u00edcio da pandemia, a
\nmetodologia padr\u00e3o ouro para o diagn\u00f3stico do Covid-19.<\/p>\n

O novo coronav\u00edrus \u00e9 um v\u00edrus encapsulado n\u00e3o segmentado, com camada de lip\u00eddeo e 29 prote\u00ednas no seu caps\u00eddeo, com 50-200 nan\u00f4metros (0.05-0.2 micras) de di\u00e2metro. Possui um genoma de RNA de fita simples, sentido positivo (+ssRNA<\/em>) extremamente longo com
\naproximadamente 30 mil nucleot\u00eddeos de comprimento distribu\u00eddo em 4 bases: Guanina<\/em>, Citosina<\/em>, Adenina<\/em> e Uracila<\/em>.<\/p>\n

O m\u00e9todo padr\u00e3o para o teste de coronav\u00edrus \u00e9 por meio da rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase amplamente utilizado na biologia molecular consistindo em amplificar, isto \u00e9 produzir milh\u00f5es a bilh\u00f5es de c\u00f3pias do material gen\u00e9tico do v\u00edrus.<\/p>\n

O RT-PCR<\/em>, em tempo real, \u00e9 utilizado para a detec\u00e7\u00e3o do novo coronav\u00edrus pela amplia\u00e7\u00e3o (aumento do n\u00famero de c\u00f3pias) da sequ\u00eancia alvo do gene Rdrp<\/em>, gene E<\/em> e gene N<\/em>.<\/p>\n

Entretanto, o desempenho anal\u00edtico deste teste \u00e9 altamente de pendente do procedimento de coleta das amostras o qual deve ser realizada por profissionais devidamente treinados munidos de EPIs , pois \u00e9 sabido que grande parte do insucesso nas an\u00e1lises de RT-PCR<\/em> se deve a erros de coleta.<\/p>\n

A amostragem, feita com swab,<\/em> \u00e9 recomendada ser feita nas vias a\u00e9reas superiores (nasofaringe e\/ou orofaringe) individualmente ou combinadas (neste \u00faltimo caso utilizam-se dois swabs<\/em>). Ap\u00f3s a coleta, o swab<\/em> \u00e9 imediatamente colocado em um tubo est\u00e9ril contendo um meio de transporte viral.<\/p>\n

Para detectar este v\u00edrus por PCR, as mol\u00e9culas de RNA devem ser convertidas em sequ\u00eancias de DNA complementar atrav\u00e9s da transcriptase<\/em> reversa de modo que o DNA rec\u00e9m formado possa ser amplificado via procedimento padr\u00e3o da PCR. Esta abordagem \u00e9
\nreconhecida universalmente como RT-PCR.<\/p>\n

Inicialmente \u00e9 necess\u00e1rio extrair e isolar o RNA alvo contido na amostra. Isto \u00e9 feito mediante a utiliza\u00e7\u00e3o de u m kit comercial Alguns procedimentos b\u00e1sicos s\u00e3o realizados para isolar e purificar o RNA : Na etapa de lise h\u00e1 a quebra da c\u00e9lula para expor o RNA; Em seguida, uma membrana de s\u00edlica ret\u00e9m e concentra o RNA. A etapa de lavagem consiste em quebrar e emulsionar a gordura e as prote\u00ednas que formam a membrana da c\u00e9lula normalmente feito utilizando solu\u00e7\u00f5es detergentes e por centrifuga\u00e7\u00e3o. As etapas de lavagem removem estes res\u00edduos contaminantes, restando apenas a membrana com o RNA. Por fim, na etapa de elui\u00e7\u00e3o, o eluente, tipo de solvente, interage com as amostras e
\npromove a separa\u00e7\u00e3o dos componentes ocorre a libera\u00e7\u00e3o dos \u00e1cidos nucl\u00e9icos (RNA) da membrana.<\/p>\n

O pr\u00f3ximo passo consiste na prepara\u00e7\u00e3o das misturas reacionais para amplifica\u00e7\u00e3o por meio da prepara\u00e7\u00e3o de um a solu\u00e7\u00e3o concentrada com o RNA purificado livre de prote\u00ednas, inibidores e outros contaminantes. Os seguintes ingredientes s\u00e3o adicionados \u00e0 solu\u00e7\u00e3o: a enzima transcriptase reversa<\/em>, a enzima Taq DNA polimerase, dois primers, um \u00edon de Magn\u00e9sio e os nucleot\u00eddeos.<\/p>\n

A Transcriptase reversa<\/em>, tamb\u00e9m chamada de DNA polimerase RNA-dependente permite a transcri\u00e7\u00e3o da informa\u00e7\u00e3o no sentido de RN A do virus , usado como um para a fabrica\u00e7\u00e3o do DNA alvo ou do fragmento alvo a ser amplificado.<\/p>\n

A Taq DNA Polimerase \u00e9 a enzima capaz de utilizar uma fita molde de DNA para sintetizar (gerar) uma nova fita complementar. Esta enzima \u00e9 extra\u00edda da bact\u00e9ria Thermus aquaticus<\/em>, que vive em \u00e1gua com temperatura de 75\u00ba C.<\/p>\n

Os primers<\/em>, tamb\u00e9m chamados de iniciadores, s\u00e3o pequenos fragmentos de DNA com cerca de 20 nucleot\u00eddeos, fita simples espec\u00edficos e complementares \u00e0s extremidades do DNA alvo que permite que a Taq DNA Polimerase d\u00ea continuidade ao processo de polimeriza\u00e7\u00e3o em cada fita.<\/p>\n

O \u00edon de Magn\u00e9sio, bivalente, geralmente Cloretxo de Magn\u00e9sio \u00e9 utilizado como co-fator da Taq DNA Polimerase tendo como fun\u00e7\u00e3o a otimiza\u00e7\u00e3o de sua atividade.<\/p>\n

Os nucleot\u00eddeos s\u00e3o as 4 bases nitrogenadas do DNA: Adenina, Timina, Citosina<\/em> e Guanina <\/em>adicionadas tamb\u00e9m \u00e0 solu\u00e7\u00e3o utilizados no processo de s\u00edntese das novas fitas.<\/p>\n

Todos estes ingredientes s\u00e3o colocados em um tubo para que a PCR ocorra. O passo 1 \u00e9 a desnatura\u00e7\u00e3o que ocorre \u00e0 uma temperatura de 90-95\u00baC, isto \u00e9, nesta temperatura, a estrutura da dupla fita do DNA se desfaz com o rompimento d as pontes de Hidrog\u00eanio formando duas fitas simples.<\/p>\n

Em seguida, com a temperat ura reduzida em torno de 58\u00baC, ocorre o anelamento , isto \u00e9 os primers v\u00e3o se anelar \u00e0s extremidades do DNA alvo.<\/p>\n

O terceiro passo (extens\u00e3o), que ocorre em torno de 72\u00baC, a Taq DNA Polimerase que tem a capacidade de identificar esta estrutura dupla fita formada pela jun\u00e7\u00e3o do seu DNA e do seu primer em decorr\u00eancia do anelamento se associa ao DNA adicionando nucleot\u00eddeos que ir\u00e3o gerar as novas fitas.<\/p>\n

Desta forma obt\u00e9m-se duas fitas id\u00eanticas de DNA. O processo prossegue repetindo se em ciclos. Ao final do segundo ciclo se ter\u00e1 4 mol\u00e9culas, 8 no terceiro e assim por diante em progress\u00e3o geom\u00e9trica, sendo necess\u00e1rio cerca de 30 a 40 ciclos para que se obtenha o n\u00famero das milh\u00f5es de c\u00f3pias necess\u00e1rias.<\/p>\n

Toda a PCR ocorre em um aparelho denominado Termociclador que tem como fun\u00e7\u00e3o variar as temperaturas ao longo dos ciclos de maneira autom\u00e1tica.<\/p>\n

Para monitorar a PCR em tempo real \u00e9 necess\u00e1rio adicionar um ingrediente extra na forma de um agente fluorescente. Os n\u00edveis de fluoresc\u00eancia que aumentam de maneira proporcional ao n\u00famero de c\u00f3pias do alvo s\u00e3o traduzidos em informa\u00e7\u00f5es digitais.<\/p>\n

Para tanto, \u00e9 necess\u00e1rio dispor de um aparelho detector das varia\u00e7\u00f5es dos n\u00edveis de fluoresc\u00eancia e uma fonte de luz espec\u00edfica emitida por uma l\u00e2mpada hal\u00f3gena de tungst\u00eanio que vai excitar a fluoresc\u00eancia. Esta luz \u00e9 recebida por uma c\u00e2mara a qual converte a luz capturada em dados digitais.<\/p>\n

Entretanto, o laudo com o resultado do teste fornecido ao paciente se limita a informar se foram ou n\u00e3o detectados os genes Rdrp, E e N do Sars-CoV-2 para detec\u00e7\u00e3o do novo coronav\u00edrus causador da Covid-19.<\/p>\n

O laborat\u00f3rio alerta no laudo que um \u00fanico resultado N\u00c3O DETECTADO para Sars-CoV-2 n\u00e3o exclui o diagn\u00f3stico da Covid-19 e que v\u00e1rios fatores como coleta inadequada da amostra, tipo de amostra biol\u00f3gica, tempo decorrido entre a coleta e o in\u00edcio dos sintomas e oscila\u00e7\u00e3o da carga viral podem influenciar o resultado do exame. Sempre que houver discord\u00e2ncia com o quadro cl\u00ednico epidemiol\u00f3gico, o exame de RT qPCR deve ser repetido em outro tipo de amostra do trato respirat\u00f3rio respirat\u00f3rio<\/p>\n

Fonte UNIMED<\/em><\/p>\n

Mais informa\u00e7\u00f5es:<\/strong> https:\/\/www.youtube.com\/watch?v=ThG_02miq-4<\/a>; https:\/\/www.youtube.com\/watch?v=h2peadwu1zk<\/a><\/p>\n

________________________________________________________________________<\/p>\n

<\/p>\n

*Jos\u00e9 Eduardo W. de A. Cavalcanti<\/strong><\/p>\n

\u00c9 engenheiro consultor, diretor do Departamento de Engenharia da Ambiental do Brasil, diretor da Divis\u00e3o de Saneamento do Deinfra \u2013 Departamento de Infraestrutura da Federa\u00e7\u00e3o das Ind\u00fastrias do Estado de S\u00e3o Paulo (Fiesp), conselheiro do Instituto de Engenharia, e membro da Comiss\u00e3o Editorial da Revista Engenharia<\/p>\n

E-mail:\u00a0cavalcanti@ambientaldobrasil.com.br<\/p>\n

*Os artigos publicados com assinatura, n\u00e3o traduzem necessariamente a opini\u00e3o do Instituto de Engenharia. Sua publica\u00e7\u00e3o obedece ao prop\u00f3sito de estimular o debate dos problemas brasileiros e de refletir as diversas tend\u00eancias do pensamento contempor\u00e2neo<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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